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            蔡司激光共聚焦顯微鏡光譜實時在線拆分模式

               01多重熒光標記的大組織樣品如何做到快速、精確的信號拆分?

              由于研究細胞生物學和組織的異質性,多重熒光標記往往帶來光譜重疊從而導致串色的可能。Rios博士團隊尋求到一種快速高效的成像策略——配備32通道光譜檢測器的蔡司激光共聚焦顯微鏡(點擊查看),以便及時對大組織、多標記樣品進行光譜拆分和成像。

            共聚焦顯微鏡

              首先Rios博士團隊從21個熒光分子中挑選出8個與光譜線性拆分軟件lambda stacks相兼容的熒光基團,它們的參考發射光譜被用于蔡司online fingerprinting 實時在線拆分模式。無需單標樣本的條件下,8個熒光團在單次掃描采集期間被精確拆分。相比于lambda stacks模式,蔡司online fingerprinting 實時在線拆分模式不需要存儲32通道lambda數據,拆分數據量減少4倍,極大縮短拆分時間,加快下游實驗分析。

              02拆分結果如何應用到多標3D厚組織樣品中?

              通過測試60多種抗體以及染料,結合多重蛋白質組學和空間轉錄組學的最新進展,Rios博士團隊選擇5種早期腎臟結構的標記物,以及用于標記細胞核的DAPI,用于標記F-actin的鬼筆環肽和用于標記處于增殖周期的細胞的KI67。腎臟樣品經過三輪免疫標記及透明化處理,保留細胞形態及組織架構。

              為了滿足3D厚樣本的多色成像,Rios博士團隊借助蔡司25x/0.8 NA的長工作距離多介質物鏡以及online fingerprinting 實時在線拆分模式,捕獲完整3D腎臟信息的同時獲取8色成像結果。蔡司共聚焦顯微鏡online fingerprinting 實時在線拆分模式搭配層掃Z-stacks以及拼圖Tile等模塊展現出獲取大樣本、厚組織3D數據集的優勢,大大減少了采集時間、重復照明造成的光漂白以及數據預處理和存儲需求。

              該方案也可以成功應用于各種組織,如人源乳腺癌的異種移植體、體外培養的乳腺癌體和源于活檢的人神經系統腫瘤中。

              03哪些可訓練的數據集

              有利于STAPL-3D軟件開發?

              STAPL-3D 分析軟件是用來從大量的3D成像數據中提取單細胞特征。為了對mLSR-3D 數據更好的分析,首先對數據進行預處理(包括陰影校正和偏差校正),減少技術背景誤差。通過分割模塊將數據集分割成單個細胞,并進一步將每個細胞的核與膜分割開來得到單細胞特征。

              要對數以萬計的細胞進行精確、可靠的核膜分割,Rios博士團隊利用蔡司Airyscan 超高分辨技術(點擊查看)在樣本同一位置通過25x及63x物鏡獲取組織3D圖像結果,產生可用于深度學習的訓練集。得益于Airyscan 的超高分辨(在高倍物鏡下實現超分辨效果,同樣兼容低倍物鏡提升圖像分辨率)以及同步提升圖像信噪比的優勢,使得對樣本細微結構和弱信號進行完整解析。

              深度學習后的STAPL-3D 軟件能夠對細胞亞結構如細胞質,甚至是線粒體提取分子標記強度、空間信息和3D形態特征,用于大規模的重建腫瘤的空間表型特征。

              總而言之,mLSR-3D 和STAPL-3D 的聯合應用揭露了之前未報告的腫瘤特異性群體,其具有獨特的空間嵌入或形態學屬性,展現出對腫瘤生物學新見解的潛力。

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